Mit Nanoporen einzelne CRISPR-Cas Botenstoffe aufspüren und identifizieren
Botenstoff-Moleküle spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Kommunikation und Signalübertragung. Einem von Sonja Schmid geleiteten interdisziplinären Team gelang nun erstmals die Detektion von CRISPR/Cas-produzierten Botenstoffen mit Einzel-Molekül-Präzision. Die neu entwickelte Methode basiert auf «Nanoporen» und benötigt keinerlei Markierungsschritte. Sie wurde in der Fachzeitschrift ACS Nano veröffentlicht.
Die auch als «Genschere» bezeichneten CRISPR/Cas-Systeme sind allgemein bekannt als nützliche Werkzeuge zum gezielten Anpassen von Genen, was in der Biotechnologie und Biomedizin sehr hilfreich ist (CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, Cas: CRISPR-assoziiertes Protein). Ursprünglich stammen diese CRISPR/Cas-Systeme allerdings aus Bakterien, wo sie ein Abwehrsystem gegen Viren bilden. Interessanterweise zeigen CRISPR/Cas-Varianten vom Typ-III eine einzigartige zweite Verteidigungsstufe: eine Zelle mit hoher Viruslast kann sich in einem altruistischen Schritt selbst zerstören, um so die weitere Virusverbreitung zu stoppen und benachbarte Zellen zu schützen. Dieser Mechanismus ist angesichts seines fatalen Ausgangs streng reguliert durch sogenannte sekundäre Botenstoffe (engl. second messengers) – im diesem Fall zyklische Oligo-Adenylat-Moleküle (cOA). Über ihre genaue Rolle und (stöchiometrische) Zusammensetzung ist allerdings noch vieles unerforscht.
Moleküle zählen – eines nach dem anderen
Die cOA-Botenstoffe konnten bislang nur entdeckt werden, wenn diese in grosser Zahl (als Ensemble) vorlagen und auch dann nur mit Hilfe teurer, grosser Messinstrumente (z.B. LC-MS). Mit dem neuen Ansatz basierend auf «Nanoporen» und maschinellem Lernen ist es nun möglich, auch einzelne cOA-Botenstoffmoleküle zu vermessen, zu zählen und zu identifizieren. Zentral für diesen Erfolg ist die neue Nanoporen-Methode, die massgeblich von Doktorand David Fuentenebro Navas aus der Forschungsgruppe um Prof. Sonja Schmid entwickelt wurde: winzige Loch-Proteine fungieren hier als Sensoren für noch kleinere Moleküle, welche beim Loch-Durchfluss elektrisch identifiziert werden – ein Molekül nach dem anderen. Dies funktioniert schnell, ohne weitere Markierungsschritte und ist mit kleinen, tragbaren und erschwinglichen Geräten möglich. Dank der Sensitivität für einzelne Moleküle lassen sich zudem auch seltene Moleküle identifizieren, die in der Biologie oft entscheidend sind, aber durch herkömmliche Messmethoden schlicht übersehen werden.
Die neue Nanoporen-Methode ermöglichte den Forschenden CRISPR-Botenstoffen, die im Bakterium Thermus thermophilus vorkommen, zu vermessen und erstmals deren Zusammensetzung zu entschlüsseln, was interessante biologischen Zusammenhänge aufdeckte. Eine künftige Anwendung des neuen Einzelmolekül-Sensors könnte darüber hinaus in biomedizinischen Point-of-Care-Geräten liegen, welche medizinische Diagnostik in unmittelbarer Nähe der zu behandelnden Patienten ermöglichen.
Originalpublikation
David Fuentenebro Navas, Jurre A. Steens, Carlos de Lannoy, Ben Noordijk, Michael Pfeffer, Dick de Ridder, Raymond H.J. Staals, Sonja Schmid
Nanopores Reveal the Stoichiometry of Single Oligoadenylates Produced by Type III CRISPR-Cas
ACS Nano 202418 (26), 16505-16515 DOI: 10.1021/acsnano.3c11769
Weiterführende Informationen
Webseite der Forschungsgruppe Schmid